Методы разрушения клеток в биотехнологии

08.10.2023

Методы разрушения клеток

Современные технологии синтеза природных соединений с использованием клонирования и культивирования клеток позволяют разрабатывать и получать биомолекулы с заданными свойствами. За исключением случаев выделения целевых биомолекул в культуральную среду, в биопроцессе требуется разрушение клеток-продуцентов для дальнейшего выделения и очистки целевых биомолекул. Для разрушения клеток используют разнообразные химические, биологические и физические методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в тоже время достаточно мягкими, чтобы исключить денатурацию белка. А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из разных полимеров, никакого универсального метода их разрушения не существует. В данной статье будут рассмотрены существующие наиболее распространенные физические методы разрушения клеток. 

Механический метод с помощью шариков

В обычном лабораторном механическом методе разрушения клеток используются стеклянные, керамические или стальные шарики диаметром от 0,1 до 2 мм, смешанные с образцом, взвешенным в водной среде. Шарики сталкиваются с клеточным образцом, открывая клетку и высвобождая межклеточные компоненты. В отличие от некоторых других методов механический сдвиг во время гомогенизации является умеренным, что приводит к качественным мембранным или субклеточным препаратам. Метод, часто называемый «битием бисером», хорошо работает для всех типов клеточного материала — от спор до тканей животных и растений. Его преимущество перед другими методами механического разрушения клеток состоит в том, что он может разрушать образцы очень малого размера, обрабатывать множество образцов одновременно, не опасаясь перекрестного загрязнения, и не выделяет в процессе потенциально вредных аэрозолей.

Гомогенизация ультразвуком

Ультразвуковая гомогенизация — это высокоэнергетический процесс, и операторы рискуют изменить молекулярный состав раствора во время обработки ультразвуком. Пользователи должны указать частоту и мощность процесса. Нуклеиновые кислоты, в частности, чувствительны к силам сдвига при обработке ультразвуком. Если образец обрабатывается со слишком высокой частотой, остов ДНК/РНК разрывается, и анализ становится невозможным. Восприимчивость нуклеиновых кислот к сдвигу также может принести пользу операторам. Если желаемым конечным продуктом является белок, пользователи захотят удалить ДНК в растворе. Ультразвук может эффективно разрушать геномные и клеточные нуклеиновые кислоты, чтобы они больше не мешали очистке белков. Наконец, высокая энергия, создаваемая ультразвуком, может нагревать образцы и приводить к денатурации белков (если образец обрабатывается в течение длительного времени). Таким образом, необходимо помнить о продолжительности, мощности и частоте, используемых для ультразвуковой гомогенизации.

Азотная декомпрессия

В методе азотной декомпрессии большие количества азота сначала растворяются в суспензии клеток под высоким давлением в подходящей емкости высокого давления. Затем, когда давление газа резко снижается, азот выходит из раствора в виде расширяющихся пузырьков, которые растягивают мембраны каждой клетки до тех пор, пока они не разрываются и не высвобождают содержимое клетки.

Азотная декомпрессия лучше защищает ферменты и органеллы, чем ультразвуковые и механические методы гомогенизации, и выгодно отличается от контролируемого разрушающего действия, получаемого в гомогенизаторе с пестиком и ступкой из политетрафторэтилена и стекла  В то время как другие разрушающие методы основаны на трении или механическом сдвиговом действии, которое выделяет тепло, процедура декомпрессии азота сопровождается адиабатическим расширением, при котором образец охлаждается, а не нагревается.

Одеяло из инертного газообразного азота, насыщающего клеточную суспензию и гомогенат, обеспечивает защиту от окисления клеточных компонентов. Хотя в этом методе использовались и другие газы: двуокись углерода, закись азота, окись углерода и сжатый воздух, азот предпочтительнее из-за его нереактивной природы и потому, что он не изменяет рН суспендирующей среды. Кроме того, предпочтительным является азот, поскольку он обычно доступен по низкой цене и при подходящем для этой процедуры давлении.

После высвобождения субклеточные вещества не подвергаются длительному истиранию, которое может денатурировать образец или вызвать нежелательные повреждения. Нет необходимости следить за пиком между активностью фермента и процентом разрушения. Поскольку в каждой ячейке образуются пузырьки азота, одна и та же разрушающая сила равномерно распределяется по всему образцу, что обеспечивает необыкновенную однородность продукта. Могут быть получены бесклеточные гомогенаты.

Этот метод используется для гомогенизации клеток и тканей, высвобождения интактных органелл, подготовки клеточных мембран, высвобождения лабильных биохимических веществ и получения однородных и воспроизводимых гомогенатов, не подвергая образец экстремальному химическому или физическому стрессу. Этот метод особенно хорошо подходит для лечения клеток млекопитающих и других мембраносвязанных клеток. 

Гомогенизация высокого давления

С 1940-х годов гомогенизация пол высоким давлением используется как метод разрушения клеток, в первую очередь французским прессом для клеток давления или сокращенно French Press. Этот метод был разработан Чарльзом Стейси Френчем и использует высокое давление для направления потока клеток через узкое отверстие, вызывая лизис клеток из-за сил сдвига, возникающих при перепаде давления. 

Современные клеточные гомогенизаторы обычно работают с помощью пневматического или гидравлического давления. Хотя пневматические машины обычно дешевле, их производительность может быть ненадежной из-за колебаний рабочего давления на протяжении всего хода воздушного насоса. Обычно считается, что гидравлические машины обладают превосходной способностью к лизису, особенно при обработке трудно разрушаемых образцов, таких как дрожжи или грамположительные бактерии, благодаря их способности поддерживать постоянное давление на протяжении всего хода поршня. Поскольку Френч-пресс, работающий под гидравлическим давлением, способен лизисировать более 90% наиболее часто используемых типов клеток, его часто считают золотым стандартом эффективности лизиса, и современные машины часто сравнивают с ним не только с точки зрения лизиса. эффективности, но и с точки зрения безопасности и простоты использования. Некоторые производители также пытаются улучшить традиционную конструкцию, изменяя свойства этих машин, помимо давления, проталкивающего образец через отверстие. 

Гомогенизаторы высокого давления с поршневым или плунжерным насосом продавливают гомогенизируемую суспензию под высоким давлением через регулируемый зазор. Такой гомогенизатор высокого давления использует физические принципы сдвига, кавитации и турбулентности для разрушения крупных частиц и капель, и получения однородной суспензии. Сила сдвига, вызванная вязкостью, уменьшает размер частиц, кавитация генерирует ударные волны, разрушающие частицы, а турбулентность, создаваемая высокой скоростью жидкости, приводит к дальнейшему уменьшению размера частиц за счет образования завихрений.