Решения BIORUS для белковой хроматографии лабораторного и промышленного масштаба
07.15.2023
Введение
Препаративная белковая хроматография является мощным инструментом для разделения и очистки белковых смесей. Белки играют важную роль в широком спектре биологических процессов, и необходимость получить высокоочищенные препараты становится все более актуальной в современной науке и медицине. Препаративная белковая хроматография предоставляет возможность разделить белковую смесь на ее составляющие компоненты и получить чистые препараты с высоким выходом.
Основным принципом препаративной белковой хроматографии является использование стационарной фазы (колонки), которая обладает свойством селективного удержания белковых молекул в зависимости от их физико-химических свойств. Это позволяет разделить белки на основе их различий в размере, заряде, гидрофобности и других параметрах.
В процессе препаративной белковой хроматографии важным этапом является выбор оптимальных условий эксперимента, таких как тип и размер частиц стационарной фазы, концентрация солей, pH и температура рабочего раствора. Эти параметры влияют на эффективность разделения и чистоту получаемого препарата.
Препаративная белковая хроматография находит применение в различных областях, включая биотехнологию, медицину, фармацевтическую и пищевую промышленность. Ее использование позволяет получить чистые белковые препараты для исследований структуры и функций белков, разработки лекарственных препаратов, производства биологически активных веществ и многих других приложений.
В данной статье мы рассмотрим основные принципы препаративной белковой хроматографии, методы разделения и очистки белков, а также устройство современных препаративных хроматографов для очистки белков.
Быстрая белковая жидкостная хроматография (FPLC)
Быстрая белковая жидкостная хроматография (FPLC) - это форма жидкостной хроматографии, которая часто используется для анализа или очистки смесей белков. Как и в других формах хроматографии, разделение возможно, поскольку различные компоненты смеси обладают различным сродством к двум материалам: движущейся жидкости (подвижная фаза) и пористому твердому веществу (неподвижная фаза). В FPLC подвижной фазой является водный раствор, или "буфер". Расход буфера регулируется насосом и обычно поддерживается постоянным, в то время как состав буфера можно изменять, отбирая жидкости в разных пропорциях из двух или более внешних резервуаров. Стационарная фаза представляет собой сорбент, состоящую из гранул, обычно сшитой агарозы, упакованных в цилиндрическую стеклянную или пластиковую колонку. Сорбенты FPLC доступны в широком диапазоне размеров гранул и поверхностных лигандов в зависимости от области применения.
Ионнообменная хроматография белков
В наиболее распространенном виде хроматографии белков, ионообменной, выбирается сорбент, при которой интересующий белок будет связываться с сорбентом посредством взаимодействия зарядов в буфере А (работающем буфере), но диссоциируется и возвращается в раствор в буфере В (буфере элюирования). Смесь, содержащую один или несколько представляющих интерес белков, растворяют в 100% буфере А и закачивают в колонку. Представляющие интерес белки связываются с сорбентом, в то время как другие компоненты переносятся в буфер. Общий расход буфера поддерживается постоянным; однако доля буфера В (буфера для "элюирования") постепенно увеличивается с 0% до 100% в соответствии с запрограммированным изменением концентрации ("градиент"). В какой-то момент во время этого процесса каждый из связанных белков диссоциирует и появляется в элюанте. Элюант проходит через два детектора, которые измеряют концентрацию соли (по электропроводности) и концентрацию белка (по поглощению ультрафиолетового света с длиной волны 280 нм). По мере элюирования каждого белка он проявляется в элюанте как "пик" концентрации белка и может быть собран для дальнейшего использования.
Гидрофобная хроматография белков
Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) разделяет белки в соответствии с различиями в их поверхностной гидрофобности. HIC использует обратимое взаимодействие между белками и гидрофобным лигандом смолы HIC.
Взаимодействие между гидрофобными белками и смолой HIC сильно зависит от рабочего буфера. Высокая концентрация соли усиливает взаимодействие. Снижение концентрации соли ослабляет взаимодействие.
Как работает гидрофобная хроматография белков?
Белки с разной степенью поверхностной гидрофобности можно разделить с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий. Белки связываются с гидрофобным лигандом на смоле HIC в связывающем буфере с высокой концентрацией соли.
Когда ионная сила буфера снижается, взаимодействие меняется на противоположное. Поэтому белок с наименьшей степенью гидрофобности элюируется первым. Наиболее гидрофобный белок элюируется последним, что требует большего снижения концентрации соли, чтобы обратить взаимодействие.
Хроматографию гидрофобного взаимодействия можно использовать для захвата, промежуточной очистки или полировки. Образцы должны иметь высокую концентрацию соли, чтобы способствовать гидрофобному взаимодействию. Это означает, что HIC хорошо подходит для этапов улавливания после очистки проб путем осаждения сульфатом аммония или для промежуточных этапов непосредственно после ионообменного разделения.
В обоих случаях образец уже находится в растворе с высоким содержанием солей. Помимо добавления большего количества соли, никакой дополнительной подготовки не требуется. Поскольку при разделении HIC интересующий белок концентрируется в уменьшенном объеме, фракции также можно направлять непосредственно на эксклюзионную хроматографию.
Гель-фильтрационная хроматография
Эксклюзионная хроматография (SEC), также известная как гель-фильтрация, является самым мягким из всех методов хроматографии. SEC разделяет молекулы по разнице в размерах, когда они проходят через смолу, упакованную в колонку. В отличие от таких методов, как ионообменная хроматография (IEX) или аффинная хроматография (AC), молекулы не связываются с хроматографической смолой, а это означает, что состав буфера не влияет напрямую на разрешение (степень разделения между пиками). Следовательно, существенным преимуществом SEC является то, что условия могут быть изменены в соответствии с типом образца или требованиями дальнейшей очистки, анализа или хранения без изменения разделения.
Сорбенты для SEC состоят из пористой матрицы сферических частиц (шариков), не обладающих реакционной способностью и адсорбционными свойствами. После того, как образец попал в колонку, молекулы, размер которых превышает размеры пор, не могут диффундировать в гранулы, поэтому они элюируются первыми. Молекулы, размеры которых варьируются от очень больших до очень маленьких, могут проникать в поры в разной степени в зависимости от их размера. Если молекула меньше наименьшей из пор в смоле, она сможет проникнуть в общий объем пор. Молекулы, которые входят в общий объем пор, элюируются последними. Образцы элюируются изократически, поэтому нет необходимости использовать разные буферы во время разделения.
Препаративная ЭХ представляет собой разделение биомолекул по размеру с высоким разрешением с фракционированием сбора для дальнейшего анализа или масштабирования. Препаративная SEC проводится для выделения одного или нескольких компонентов образца. Разделенные компоненты могут быть непосредственно перенесены в подходящий буфер для анализа или хранения. Объем пробы от 0,5% до 4% от общего объема колонки применяется при низкой скорости потока с использованием длинных колонок, часто 60 см или более. Поскольку разделение происходит только в 1 CV, важно иметь хорошо заполненную колонку для хороших результатов в SEC. Для удобства и оптимальной производительности рекомендуются предварительно упакованные колонки SEC.
Афинная хроматография
Аффинная хроматография (АС) разделяет белки на основе обратимого взаимодействия между белком-мишенью и специфическим лигандом, присоединенным к базовой хроматографической матрице.
Взаимодействие может быть биоспецифическим, например, антитело связывает белок А или рецептор, связывающий гормон; или небиоспецифические, например белок, связывающий красящее вещество, или гистидинсодержащие белки, связывающие ионы металлов, как в аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов (IMAC).
В аффинной хроматографии (белок-мишень специфически и обратимо связывается дополнительным связывающим веществом (лигандом). Образец наносится в условиях, способствующих специфическому связыванию с лигандом. Несвязавшийся материал вымывается из колонки.
Связанный целевой белок извлекают путем изменения условий на условия, благоприятствующие элюированию. Элюцию проводят специфически, используя конкурентный лиганд, или неспецифически, изменяя, например, рН, ионную силу или полярность. Целевой белок элюируется в очищенной и концентрированной форме.
Благодаря высокой селективности аффинную хроматографию можно использовать для одностадийной очистки. Однако чаще AC используется в качестве первой стадии улавливания, за которой следует одна или несколько стадий полировки для удаления оставшихся примесей.
Например, лиганды белка A или белка G, связанные с матрицей на основе агарозы, используются для рутинной очистки антител.
Сегодня большинство лабораторных очисток проводится с использованием белков с аффинной меткой. Белки, меченные гистидином, очищают с использованием IMAC, а белки, меченные глутатион-S-трансферазой (GST), очищают с использованием хроматографического сорбента с иммобилизованным глутатионом.
Аффинная хроматография также используется для удаления специфических примесей.
Особенности белковой хроматографии
FPLC была разработана и выпущена на рынок в Швеции Pharmacia в 1982 году и первоначально называлась высокоэффективной жидкостной хроматографией в отличие от ВЭЖХ или высокоэффективной жидкостной хроматографии. FPLC обычно применяется только к белкам; однако из-за широкого выбора смол и буферов она имеет широкое применение. В отличие от ВЭЖХ, используемое давление буфера относительно низкое, обычно менее 5 бар, но скорость потока относительно высока, обычно 1-5 мл/мин. FPLC можно легко масштабировать от анализа миллиграммов смесей в колонках общим объемом 5 мл или менее до промышленного производства килограммов очищенного белка в колонках объемом во много литров. При использовании для анализа смесей элюант обычно собирается во фракциях по 1-5 мл, которые могут быть дополнительно проанализированы (например, с помощью масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией с помощью матрицы (MALDI)). При использовании для очистки белков может быть только два контейнера для сбора: один для очищенного продукта и один для отходов.
Основные компоненты препаративных FPLC хроматографов
Типичная лабораторная FPLC система для белковой хроматографии состоит из одного или двух высокоточных насосов, блока управления, колонки, системы детектирования и коллектора фракций. Хотя системой можно управлять вручную, компоненты обычно подключаются к персональному компьютеру или, в более старых устройствах, к микроконтроллеру.
Насосы
В большинстве систем используются два двухцилиндровых поршневых насоса, по одному для каждого буфера, объединяющих производительность обоих в камере смешивания. В некоторых более простых системах используется один перистальтический насос, который забирает оба буфера из отдельных резервуаров через дозирующий клапан и смесительную камеру. В любом случае система позволяет непрерывно изменять фракцию каждого буфера, поступающего в колонку. Скорость потока может варьироваться от нескольких миллилитров в минуту в настольных системах до литров в минуту при очистке в промышленных масштабах. Широкий диапазон расхода делает ее пригодной как для аналитической, так и для препаративной хроматографии.
Инъекционная петля
Инъекционная петля представляет собой отрезок трубки известного объема, который заполняется раствором образца перед его впрыском в колонку. Объем петли может варьироваться от нескольких микролитров до 50 мл и более.
Инжекционный клапан
Инжекционный клапан представляет собой моторизованный клапан, который соединяет смеситель и контур отбора проб с колонкой. Обычно клапан имеет три положения для загрузки контура отбора проб, для впрыска пробы из контура в колонку и для подключения насосов непосредственно к линии отвода отходов для их промывки или замены буферных растворов. Клапан для инъекций имеет отверстие для загрузки образца, через которое образец может быть загружен в контур для инъекций, обычно из шприца для подкожных инъекций с использованием соединения Luer-lock.
Колонка
Хроматографическая колонка представляет собой стеклянный или пластиковый цилиндр, заполненный шариками смолы и буферным раствором. Обычно она устанавливается вертикально так, чтобы буфер стекал сверху вниз. Стеклянная фритта в нижней части колонки удерживает гранулы смолы в колонке, позволяя буферу и растворенным белкам выходить наружу.
Проточная ячейка
Элюант из колонки проходит через одну или несколько проточных ячеек для измерения концентрации белка в элюанте (по поглощению ультрафиолетового света при 280 нм). Ячейка проводимости измеряет проводимость буфера, обычно в миллисементах/см, что указывает на концентрацию соли в буфере. Также обычно используется проточная ячейка, которая измеряет рН буфера. Обычно каждая проточная ячейка подключается к отдельному электронному модулю, который обеспечивает питание и усиливает сигнал.
Детектор
Проточные ячейки подключены к дисплею и / или регистратору. В старых системах это был простой регистратор диаграмм, в современных системах используется компьютер с аппаратным интерфейсом и дисплеем. Это позволяет экспериментатору определить, когда возникают пики концентрации белка, указывающие на то, что элюируются определенные компоненты смеси.
Коллектор фракций
Коллектор фракций обычно представляет собой вращающуюся стойку, которая может быть заполнена пробирками или подобными контейнерами. Она позволяет собирать образцы в фиксированных объемах или может управляться для направления определенных фракций, обнаруживаемых в виде пиков концентрации белка, в отдельные контейнеры.
Многие системы включают различные дополнительные компоненты. Для минимизации засорения между смесителем и колонкой может быть установлен фильтр. В больших колонках FPLC образец может загружаться в колонку непосредственно с использованием небольшого перистальтического насоса, а не контура впрыска. Когда буфер содержит растворенный газ, при падении давления на выходе буфера из колонки могут образовываться пузырьки; эти пузырьки создают артефакты, если они проходят через проточные ячейки. Этого можно избежать путем дегазации буферов, например, с помощью дегазатора, или путем добавления ограничителя потока после проточных ячеек для поддержания давления 1-5 бар в линии элюирования.
BIORUS предлагает лабораторные и промышленные хроматографические системы для очистки белков (препаративные хроматографы низкого и среднего давления):
• Лабораторные и пилотные хроматографы BIORUS (аналоги хроматографов AKTA Go, AKTA Pure, AKTA Avant, AKTA Pilot)
• Промышленные хроматографы BIORUS (аналоги хроматографов AKTA Process)