Виды хроматографии для очистки белков и природных соединений: ионообменная хроматография
01.10.2024
Ионообменная хроматография
Разделение молекул при помощи адсорбционной хроматографии зависит от различных типов взаимодействия между анализируемыми молекулами и лигандами, иммобилизованными на поверхности хроматографической матрицы. Впервые успешное разделение биологических макромолекул было проведено в системе заряженных макромолекул в растворе и противоположно-заряженных компонентов, пришитых на поверхности твердой хроматографической матрицы. На этом принципе основан метод ионообменной хроматографии.
Ионообменная хроматография, пожалуй, наиболее распространенный метод разделения и выделения белков и природных соединений. Широкая распространенность метода связана с его высокой разрешающей способностью, применимостью к различным молекулам, высокой емкостью сорбентов, а также относительной простотой и высокой воспроизводимостью.
Разделение на ионообменнике происходит за счет обратимой сорбции заряженных макро-молекул образца на привитых ионообменных группах носителя, имеющих противоположный заряд (рис. 4).
Рис. 4. Упрощенная схема взаимодействий в системе ионообменник-биомолекула-противоионы
Большинство процессов разделения на ионообменнике можно разделить на следующие стадии – уравновешивание носителя в стартовых хроматографических условиях, адсорбция молекул образца, начало и конец процесса десорбции и регенерацию носителя.
На первой стадии уравновешивания хроматографический носитель переводят в стартовые условия (рН, состав буфера и ионная сила), которые обеспечивают сорбцию интересующих молекул образца. На этой стадии привитые ионообменные группы носителя насыщаются соответствующими противоионами (напр. простыми катионами или анионами, такими как ионы хлора или натрия).
На второй стадии происходит сорбция образца, во время которой происходит замещение противоионов заряженными молекулами. Несвязавшуюся часть образца вымывают из колонки стартовым буфером (рис. 5, а).
На третьей стадии в состав буфера водятся такие компоненты, которые нарушают взаимодействие между носителем и связавшимся образцом и молекулы образца элюируются из колонки. Для этих целей обычно используют градиентное элюирование возрастающей концентрацией соли или изменение рН. В процессе градиентного элюирования вначале выходят слабосвязавшиеся компоненты, сильно сорбирующиеся компоненты выходят в конце процесса (рис. 5, б).
Четвертая стадия – регенерация – необходима для удаления неэлюированных остатков образца и подготовка носителя для последующих разделений.
Рис. 5. Нанесение белковой молекулы на катионообменник (а.) и элюирование в градиенте соли (б.)
В ионообменной хроматографии можно применять два метода выделения интересующих макромолекул. Первый заключается в связывании молекул интереса на материале носителя, отделении примесей промывкой и градиентном элюировании связавшихся компонентов. Второй метод, наоборот, заключается в связывании примесей, а выделяемые молекулы, не сорбируясь, проходят через колонку. В большинстве случаев используют первый метод, поскольку он позволяет проводить не только более тонкое фракционирование, но и концентрирование компонентов.
Матрицы для ионообменных хроматографических сорбентов
Ионообменник состоит из нерастворимой матрицы, к которой ковалентно пришиты заряженные группы, а в растворе вокруг этих частиц находятся ионы противоположного заряда. Носители с положительнозаряженными группами называются анионообменниками, поскольку позволяют проводить обмен отрицательнозаряженных анионов. Носители с отрацательнозаряженными группами называются катионообменниками.
Материал матрицы может быть изготовлен из неорганических материалов, синтетических полимеров или полисахаридов. Материал матрицы определяет ее хроматографические свойства (эффективность, емкость, скорость потока элюента), а также химическую и механическую стабильность.
Первые матрицы ионообменников для разделения биомолекул были из целлюлозы, однако они имели ряд недостатков, в частности, невысокую емкость и нерегулярную форму гранул, что создавало существенное противодавление даже при небольшой скорости потока. Сферические ионообменники на основе декстрана (Sephadex), агарозы (Sepharose) и поперечно-сшитой целлюлозы (Sephacel), во многом, лишены этих недостатков. Они обладают высокой пористостью и, как следствие, емкостью и обеспечивают хорошие характеристики потока элюента. Дальнейшее развитие технологий получения сферических пористых частиц привело к созданию сорбентов на основе поперечно-сшитой агарозы (Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow), а также класса синтетических полимерных матриц типа MonoBeads и SOURCE. Хроматографические сорбенты на основе современных матриц позволяют проводить хроматографический процесс при большой скорости потока с высоким разрешением, обладают высокой емкостью и стабильностью.
Заряженные группы ионообменников
Наличие и свойства заряженных функциональных групп определяют свойства всего ионообменника, такие как тип и сила. Концентрация ионообменных групп на поверхности матрицы определяет емкость хроматографического носителя.
Ионообменники можно разделить на катионообменники и анионообменники (рис. 6), которые могут быть сильными и слабыми (табл. 1).
Рис. 6. Схематическое изображение гранул ионообменников
Табл. 1. Типичные группы, используемые для получения ионообменников
|
Анионообменники |
Функциональная группа |
|
|
Слабые |
Диэтиламиноэтил (DEAE, ДЭАЭ) |
-O-(CH2)2-N+H(CH2CH3)2 |
|
Сильные |
Четвертичный аминоэтил (QAE) |
-O-(CH2)2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3 |
|
Четвертичный амин (Q) |
-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 |
|
|
Катионообменники |
|
|
|
Слабые |
Карбоксиметил (СМ) |
-О-СН2-СОО- |
|
Сильные |
Сульфопропил (SP) |
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3- |
|
Метилсульфонат (S) |
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH- CH2SO3- |
|
Сульфогруппы и четвертичные амины используются для получения сильных ионообменников, остальные группы используются для слабых. Следует обратить внимание, что термины «сильные и слабые ионообменники» характеризуют способность к ионизации в зависимости от рН, а не силу взаимодействия с сорбируемым веществом. Сильные ионообменники заряжены в широком диапазоне рН, в то время, как степень диссоциации слабых ионообменников, и, следовательно, емкость, меняется при различных значениях рН.
Из вышесказанного можно сделать несколько выводов:
- Емкость сильных ионообменников не снижается при высоких или низких значениях рН из-за потери заряда ионообменником.
- Механизм сорбции между сильными ионообменниками и образцом достаточно простой, что существенно облегчает контроль процесса ионного обмена при различных значениях рН и улучшает воспроизводимость анализа.
Примеры разделения биомолекул методом ионообменной хроматографии.
Рис. 7. Двухстадийная схема выделения индивидуального фермента с использованием последовательной комбинации стадий анионообменной и катионообменной хроматографии
Рис. 8. Разделение нуклеотидов на анионообменной колонке высокого разрешения
Хроматографические системы для разделения белков и природных соединений:
Хроматограф среднего давления PROPS 25 для МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва - BIORUS (bio-rus.ru)