Современные технологии клеточного сортинга и его применение в биотехнологии

08.10.2023

Сортировка клеток (клеточный сортинг) — это процесс, посредством которого определенный тип клеток отделяется от других, содержащихся в образце, на основе их физических или биологических свойств, таких как размер, морфологические параметры, жизнеспособность и как внеклеточная, так и внутриклеточная экспрессия белка. Однородная клеточная популяция, полученная после сортировки, может использоваться для различных приложений, включая исследования, диагностику и терапию.

Классические методы сортировки клеток

Методы сортировки клеток (а также принципы работы клеточных сортеров) делятся на две основные категории: сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS) и сортировка иммуномагнитных клеток. Однако в последнее время набирают популярность клеточные сортеры на основе микрофлюидики, которые имеют много преимуществ по сравнению сортерами клеток, принцип работы которых основан на активируемой флуоресценции и иммуномагнитной сепарации.

Сортировка клеток с активацией флуоресценции

Сортировка клеток с активацией флуоресценции также известна как сортировка клеток с помощью проточной цитометрии или широко известна под аббревиатурой FACS, которая является товарным знаком компании Becton Dickinson. Сортировка клеток с активированной флуоресценцией использует проточную цитометрию для разделения клеток на основе морфологических параметров и экспрессии множества внеклеточных и внутриклеточных белков.

Этот метод позволяет проводить многопараметрическую сортировку клеток и включает инкапсуляцию клеток в небольшие капли жидкости, которым избирательно придают электрические заряды и которые сортируются внешним электрическим полем. Сортировка клеток с активированной флуоресценцией имеет несколько систем, которые работают вместе для достижения успешной сортировки интересующих событий. К ним относятся жидкостные, оптические и электростатические системы. Жидкостная система должна обеспечить точное время отрыва от потока жидкости в виде небольших однородных капель, чтобы капли, содержащие отдельные клетки, могли затем электростатически отклоняться. На основе изобретения Ричарда Свита образование капель жидкости струю сортировщика клеток стабилизируют колебаниями ультразвукового преобразователя на выходе из отверстия сопла. Возмущения нарастают экспоненциально и приводят к дроблению струи на капли с точным временем. Интересующая ячейка, которая должна быть отсортирована, измеряется в зоне обнаружения и перемещается вниз по потоку к точке разрыва. Во время отделения капли с находящейся в ней клеткой от неповрежденной струи жидкости на струю жидкости подается импульс напряжения, так что капли, содержащие интересующие клетки, могут отклоняться в электрическом поле между двумя отклоняющими пластинами для сортировки. Затем капли улавливаются сборными трубками или сосудами, расположенными под отклоняющими пластинами.Сортировка клеток методом проточной цитометрии дает очень высокую специфичность по одному или нескольким поверхностным маркерам, но одно ограничение состоит в количестве клеток, которые можно обработать в течение рабочего дня.

По этой причине часто рассматривается предварительное обогащение интересующей популяции с помощью иммуномагнитной сортировки клеток, особенно когда клетки-мишени сравнительно редки и необходимо обработать большую партию клеток. Более того, клеточные сортеры для проточной цитометрии представляют собой сложные инструменты, которые обычно используются только хорошо обученным персоналом в центрах проточной цитометрии или хорошо оборудованных лабораториях, и, поскольку они обычно имеют большие размеры, не всегда возможно разместить их в биологической безопасности. кабинет.

Таким образом, не всегда возможно обеспечить стерильность образцов, а поскольку жидкостные системы можно очищать, но это не одноразовое использование, существует вероятность перекрестного загрязнения образцов. Еще один аспект, который следует учитывать, заключается в том, что образование капель внутри прибора может привести к образованию аэрозолей, опасных для оператора при использовании инфицированных образцов. Исследователи могут использовать различные флуоресцентные красители для создания многоцветных панелей для успешной одновременной сортировки нескольких точно определенных типов клеток.

Иммуномагнитная сортировка клеток

Иммуномагнитная сортировка клеток также известна как иммуномагнитное разделение клеток, обогащение иммуномагнитных клеток или магнитно-активированная сортировка клеток и широко известна под аббревиатурой MACS, которая является товарным знаком Miltenyi GmbH. Иммуномагнитная сортировка клеток основана на разделении шариков, проходящих через магнитное поле. Различные компании предлагают различные решения для обогащения или истощения клеточных популяций. Иммуномагнитная сортировка клеток обеспечивает метод обогащения гетерогенной смеси клеток на основе экспрессии белков клеточной поверхности (антигенов). Эта технология основана на прикреплении небольших инертных супрамагнитных частиц к моноклональным антителам, специфичным к антигенам в популяции клеток-мишеней. Клетки, помеченные этими конъюгатами антитело-гранулы, затем разделяют через колонку, содержащую ферромагнитную матрицу. При приложении магнитного поля к матрице шарики прилипают к матрице внутри столбца, а клетки, несущие шарики, удерживаются от прохождения. Немеченые клетки могут проходить через матрицу и собираются в проточном режиме. Для элюирования захваченных клеток из колонки магнитное поле просто отключается. Таким образом, иммуномагнитная сортировка клеток позволяет использовать различные стратегии положительного обогащения или истощения клеток. Иммуномагнитные гранулы маленькие и обычно не мешают дальнейшим анализам, однако в некоторых случаях может потребоваться их удаление. При использовании этого метода разделения увеличение числа клеток не приводит к значительному увеличению времени обработки, а стерильность образца гарантируется, если сортировка клеток выполняется внутри бокса биобезопасности. С другой стороны, этот метод позволяет разделить клетки только на основе одного маркера и не позволяет различать разные уровни экспрессии белка (количественный анализ).

Сортировка клеток на основе микрофлюидных технологий

Из-за различных ограничений флуоресцентно-активируемых и иммуномагнитных устройств для сортировки клеток появился широкий спектр микрожидкостных устройств для сортировки клеток. Некоторые из них сейчас коммерчески доступны или находятся в коммерческой разработке. В исследованиях конструкций микрофлюидных сортировщиков клеток часто используются методы мягкой литографии с использованием таких материалов, как полидиметилсилоксан.

Ключевым преимуществом микрофлюидных сортеров клеток является возможность выполнять флуоресцентно-активированную сортировку клеток в закрытом одноразовом стерильном картридже. Такой закрытый картридж предотвратит воздействие на оператора биологических опасностей из-за капель, испускаемых системами FACS. Другие преимущества включают меньшее воздействие на жизнеспособность клеток из-за снижения гидродинамической нагрузки на клетки; Некоторые опубликованные устройства демонстрируют потенциал многосторонней сортировки, снижение стоимости картриджа за счет недорогих методов производства, более низкое энергопотребление и меньшие размеры, при этом некоторые устройства имеют размер кредитной карты. Некоторые из них добились высокой чистоты и скорости примерно до 50 000 клеток в секунду.

Микрофлюидные сортеры клеток можно разделить на две категории: активные и пассивные. Активные устройства отклоняют отдельные клетки за счет цитометрических измерений клеток, производимых в режиме реального времени. Пассивные устройства используют физические различия между клетками в том, как они взаимодействуют с потоком жидкости или поверхностями.

Активные сортеры клеток

Активные микрожидкостные клеточные сортеры включают отклонение отдельных клеток после их измерения с использованием цитометрических методов, включая флуоресцентное мечение, светорассеяние и анализ изображений. Отдельные клетки отклоняются либо силой, непосредственно действующей на клетку, либо силой, действующей на жидкость, окружающую клетки, так что они текут в отдельные выходные сосуды.

В методах отклонения клеток используется несколько видов макроскопических, оптических или МЭМС (микроэлектромеханических систем) приводов для отклонения объема частиц или жидкости внутри микроканала. Известные недавние примеры основаны на актуаторах на поверхностных акустических волнах, макроскопических актуаторах (таких как пьезоэлектрические актуаторы), связанных с микроканалами. диэлектрофорез капель, тепловые приводы пузырьков пара, переходные микровихри, генерируемые приводами тепловых пузырьков пара, [28] оптические манипуляции, и микромеханические клапаны. Самые быстрые из них продемонстрировали скорость сортировки, превышающую 1000 / с, и потенциальную максимальную пропускную способность, в некоторых случаях приближающуюся к скорости FACS. Активная микрожидкостная сортировка клеток требует такого же цитометрического оборудования, как описанная выше сортировка клеток, активируемая флуоресценцией.

Активные микрожидкостные сортировщики клеток обладают потенциалом масштабирования пропускной способности за счет распараллеливания на кристалле.Самое быстрое опубликованное активное микрожидкостное сортировочное устройство продемонстрировало пропускную способность 160 000/с.

Пассивные сортеры клеток

Пассивная сортировка клеток использует поведение жидкости в микроканалах для изменения и разделения клеток в зависимости от размера и морфологии. Жидкость в коллоидном растворе имеет профиль скорости из-за взаимодействия жидкости со стенками канала; ячейки в растворе подвергаются различным силам сопротивления и инерции, которые зависят от размера ячейки и соответственно уравновешиваются в разных местах на профиле скорости. В изогнутых микрофлюидных каналах вихри образуются из-за силы Дина, которая размещает частицы разного размера в разных местах поперечного сечения из-за числа Рейнольдса и радиуса кривизны кривой.

Например, в прямом канале более крупные клетки в коллоидном растворе находятся ближе к центру микроканала, чем более мелкие из-за больших сил сопротивления стенки, которые отталкивают клетку от стенки, и силы градиента сдвига от скорости профиль, который уравновешивает эту силу сопротивления стенки, чтобы установить ячейку в равновесие.

Некоторые приложения сортировки клеток в биотехнологии

Клеточная сортировка является чрезвычайно мощным методом скрининга очень больших популяций одиночных клеток. Поэтому совершенно очевидно применять сортировку клеток для скрининга редких событий. Потенциальные применения широко распространены и очень универсальны, ограничиваясь главным образом техническими возможностями метода сортировки. Биотехнологические приложения можно отнести либо к скринингу специфических свойств биомолекул, в основном белков, либо к скринингу клеток со специфическими характеристиками.

Белковая инженерия

Оптимизация белковых структур для улучшения их специфических свойств, таких как ферментативная активность, специфичность, связывание с лигандами, аффинность или стабильность, является важной задачей для разработки биотехнологических продуктов и процессов. В то время как рациональный дизайн белков является сложной задачей, скрининг случайных библиотек оказался ценной альтернативой во многих случаях. Классическим методом случайного скрининга является фаговый дисплей библиотек антител. Фаговый дисплей можно рассматривать как первый пример методов поверхностного дисплея, которые разделяют общий принцип, заключающийся в том, что белок, закодированный в геноме клетки-хозяина (или вируса), отображается как слитый белок на внешней поверхности одного и того же вируса. Следовательно, генетическая информация всегда связана с соответствующим вариантом белка в одной и той же клетке. Опубликовано множество приложений фагового дисплея и дисплея клеточной поверхности. Как правило, целевой (поли)пептид сливают с нативным поверхностно-связанным белком, будь то на капсиде вируса, клеточная мембрана или клеточная стенка.

Скрининг на связывание

Две основные характеристики связывающих молекул являются мишенями для оптимизации: специфичность и аффинность. Фаговый дисплей оказался наиболее ценным инструментом для скрининга белков, специфически связывающихся с различными классами лигандов, и обычно использует «пэннинг» в качестве этапа скрининга. Хотя панорамирование фаговых библиотек является надежным и простым в обращении методом, существуют некоторые недостатки, связанные с введением разнообразия и скринингом кинетики, которые можно преодолеть, используя экспрессию клеточной поверхности и FACS. Поверхностный дисплей на бактериальных клетках и дрожжевых клетках успешно применялся при сортировке клеток для повышения аффинности фрагментов одноцепочечных Fv-антител из библиотек мутантов. 

Помимо отбора мутантов антител, поверхностный дисплей и FACS также применялись для скрининга пептидных библиотек на лиганд-связывающие пептиды. Поверхностный дисплей Escherichia coli использовали в комбинированной процедуре MACS и FACS для выделения пептидов, которые с высокой аффинностью связываются с различными белковыми лигандами.

Скрининг ферментативной активности

Скрининг на связывание лиганда довольно прямолинеен с точки зрения сортировки клеток, поскольку связывание флуоресцентного зонда с клеткой является неотъемлемой чертой желаемой модели. Наоборот, система скрининга новых или улучшенных ферментативных активностей должна быть гораздо более сложной. Основная проблема, которую необходимо решить, состоит в том, чтобы связать сигнал (продукт желаемой реакции) с клеткой, вырабатывающей фермент, катализирующий эту реакцию. Хотя связать фермент (или мутантную библиотеку) с экспрессирующей клеткой с помощью одной из вышеописанных систем отображения клеточной поверхности довольно просто, связывание продуктов ферментативной реакции более ограничено и требует рассмотрения в каждом случае. 

Более радикальный подход к скринингу оптимизированных ферментов основан на бесклеточной транскрипции и трансляции в эмульсиях вода-в-масле (компартментализация in vitro, IVC), которые также могут быть проверены с помощью FACS. 

Клеточная инженерия

Расширяя область за пределами белковой инженерии, можно предусмотреть чрезвычайно широкий спектр приложений клеточной инженерии для сортировки отдельных клеток. Несмотря на возможность скрининга множества различных клеточных характеристик, клеточная сортировка до сих пор применялась лишь в довольно небольшом числе случаев клеточной инженерии.

Одной из основных проблем улучшения штамма является изоляция успешных событий гибридизации, т.е. после слияния клеток (или протопластов) или спаривания клеток. Например, FACS применяли для выделения редких скрещивающихся гибридов дрожжей без селективных маркеров. 

Концептуальное расширение позволит проводить скрининг самых разных генетических модификаций, таких как клонирование случайной библиотеки в определенное положение или генов с определенными желаемыми функциями.

Некоторыми другими примерами являются оптимизация протоколов трансфекции рекомбинантных клеток, а также выбор новых и сильных промоторов. Дестабилизированный GFP, который не накапливается в клетках, использовали для характеристики кинетики новых промоторов или идентификации последовательностей, усиливающих секрецию. Часто используемыми инструментами для этого типа исследований являются репортерные гены, такие как ?-галактозидаза или GFP.

Улучшение клеточных свойств, таких как жизнеспособность или стрессоустойчивость, может быть напрямую связано с улучшенным перепроизводством желаемого биотехнологического продукта. В качестве наглядного примера показано, что скрининг дрожжевых клеток с повышенной устойчивостью к слабым органическим кислотам в кислой среде приводит непосредственно к штаммам с повышенной способностью продуцировать молочную кислоту. На основании наблюдения, что клетки с более высоким внутриклеточным pH обладают лучшей устойчивостью к кислым условиям, была разработана стратегия сортировки FACS. 

Другие свойства клеток, которые были выбраны путем сортировки клеток, касаются поведения клеток во время крупномасштабного производства, а также стабильности экспрессии рекомбинантного гена в клетках СНО.