Оборудование. BIORUS® - Все для масштабируемой биотехнологии.

Терапевтические олигонуклеотиды и их получение

12.31.2023

Терапевтические олигонуклеотиды и их получение

Олигонуклеотидная терапия


Олигонуклеотидная терапия — это новые методы лечения, в которых используются небольшие фрагменты ДНК или РНК, известные как олигонуклеотиды, для лечения широкого спектра заболеваний и состояний. Эти олигонуклеотиды могут быть созданы для воздействия на определенные гены или последовательности генов, вызывающие заболевания.

Олигонуклеотидные препараты вводятся в организм для лечения генетических нарушений, рака и некоторых инфекционных заболеваний. Существует несколько различных подходов к терапии олигонуклеотидами, включая антисмысловые олигонуклеотиды, РНК-интерференцию и терапию на основе CRISPR. Каждый подход имеет свои области применения, поэтому выбор аналитических технологий требует тщательного рассмотрения.

Синтез олигонуклеотидов

Синтез олигонуклеотидов — это процесс производства коротких одноцепочечных молекул ДНК с точными последовательностями. Возможность синтезировать индивидуальные олигонуклеотиды ДНК со специфическими последовательностями расширила диапазон применений в науках о жизни — от фундаментальных исследований до терапии.

Пользовательские олигонуклеотиды часто используются в качестве зондов для обнаружения определенных последовательностей ДНК или в качестве праймеров для ПЦР (полимеразной цепной реакции) для амплификации определенных участков ДНК. Включение модифицированных оснований в олигонуклеотиды привело к новым достижениям в генной терапии и других приложениях.

Об олигонуклеотидах

Синтетические (модифицированные) нуклеотиды, используемые в синтезе олигонуклеотидов, включают dATP, dCTP, dGTP и dTTP, которые представляют собой дезоксирибонуклеозидтрифосфаты оснований аденина, цитозина, гуанина и тимина соответственно. dUTP представляет собой модифицированный нуклеотид, используемый в синтезе олигонуклеотидов для замены dTTP и создания олигонуклеотидов РНК, содержащих уридин вместо тимина. Это позволяет создавать зонды РНК и ингибировать определенные гены посредством антисмысловой терапии и РНК-интерференции. Эти нуклеотиды используются в ПЦР и секвенировании ДНК. Другие модифицированные нуклеотиды используются для стабилизации олигонуклеотидов и уменьшения деградации под действием нуклеаз.

Олигонуклеотиды различаются по длине от 5 до 120 и более нуклеотидов в зависимости от применения. Например, длина олигонуклеотидных праймеров для ПЦР варьируется от 18 до 25 нуклеотидов.

Изготовление длинных олигонуклеотидов является сложной задачей, поскольку этот процесс подвержен ошибкам, таким как неправильное включение оснований и усечение, которые становятся более частыми по мере увеличения длины олигонуклеотида. Кроме того, выход синтеза снижается по мере увеличения длины, что затрудняет получение достаточного количества желаемого продукта.

Синтез олигонуклеотидов: фосфорамидитный метод

Фосфорамидитный метод широко используется благодаря точности секвенирования при получении высококачественных одноцепочечных олигонуклеотидов ДНК или РНК. Он широко используется в молекулярной биологии, генной инженерии и разработке лекарств. Этот высокоэффективный, точный и экономически выгодный метод позволяет получать высококачественные олигонуклеотиды с точными последовательностями. Кроме того, этот метод обеспечивает большую гибкость при модификации олигонуклеотидов.

Шаг 1 – Детритилирование олигонуклеотидов

Фосфорамидиты представляют собой защищенные нуклеозиды, содержащие фосфатную группу и аминогруппу. Они собираются на подложке из стекла с контролируемым пористостью (CPG) с помощью непрерывного процесса потока (еще одним вариантом подложки является полистирол). Первым шагом в синтезе является снятие защиты с 5'-гидроксильной группы (5'-ДМТ) носителя CPG.

Детритилирование олигонуклеотидов относится к процессу удаления защитных групп (также известных как «протекторы» или «кэпирующие группы») с концов (концов) синтезированного олигонуклеотида. Эти защитные группы добавляются во время синтеза, чтобы предотвратить разрушение или модификацию олигонуклеотида в результате нежелательных реакций.

Детритилирование обычно включает использование химических реагентов, таких как растворы кислот или оснований, для отщепления защитных групп от олигонуклеотида. Например, если защитная группа представляет собой диметокситритильную (ДМТ) группу, ее можно удалить обработкой раствором сильной кислоты, такой как трифторуксусная кислота (ТФУ). Кислый раствор отщепляет группу ДМТ от олигонуклеотида, оставляя незащищенные концы доступными для дальнейших реакций или применений.

Детритилирование является важным этапом олигосинтеза, поскольку оно позволяет использовать олигонуклеотид в последующих приложениях, таких как ПЦР, секвенирование или анализы гибридизации, без вмешательства со стороны защитных групп. Кроме того, детритилирование также можно использовать для очистки олигонуклеотида путем удаления любых примесей или побочных продуктов, которые могли образоваться в процессе синтеза.

Шаг 2 – Связывание олигонуклеотидов

Соединение олигонуклеотидов соединяет два или более отдельных олигонуклеотидов вместе с использованием фосфорамидитов с образованием ковалентной связи между 5'-фосфатной группой одного олигонуклеотида и 3'-гидроксильной группой другого. Такое образование связи обычно осуществляется в присутствии катализатора, такого как ион металла, и при определенных условиях температуры и pH. Процесс обычно автоматизирован и осуществляется поэтапно, при этом каждая последующая реакция сочетания строится на основе предыдущей, создавая более длинный олигонуклеотид.

Шаг 3 – Кэпирование олигонуклеотидов

Методы кэпирования олигонуклеотидов — это методы, используемые для добавления модифицированного основания или химической группы к концам олигонуклеотида. Эти модификации могут служить различным целям, таким как повышение стабильности или специфичности или предотвращение появления олигонуклеотидов с делеционными мутациями, вызванными непрореагировавшими 5’-гидроксильными группами.

Шаг 4 – Окисление олигонуклеотидов

После фазы кэпирования к реакции синтеза олигонуклеотидов добавляется окислитель. Реакцию обычно контролируют с помощью гель- или капиллярного электрофореза, масс-спектрометрии или хроматографии, чтобы гарантировать достижение желаемого уровня окисления.

Этот процесс включает использование окислителя, такого как йод и вода, который окисляет фосфит в фосфат и приводит к образованию фосфодиэфирной связи между олигонуклеотидом и добавленным нуклеотидом. Затем олигонуклеотид отщепляют от носителя CPG с использованием концентрированного раствора аммиака.

Фосфорамидитный метод позволяет многократно добавлять нуклеотиды к растущей олигонуклеотидной цепи, при этом каждый нуклеотид добавляется по одному поэтапно. В результате этого процесса синтезируется одноцепочечный олигонуклеотид ДНК или РНК с желаемой последовательностью.

Химические модификации олигонуклеотидов

Химические модификации основной цепи или базовой структуры могут улучшить свойства олигонуклеотидов и расширить диапазон их применения. Возможность контролировать последовательность и модификации олигонуклеотидов предоставляет исследователям универсальную платформу для разработки зондов, праймеров и терапевтических агентов, которые можно адаптировать к конкретным потребностям.

Одной из распространенных модификаций является введение ненуклеотидных связей, таких как фосфоротиоат или метилфосфонат. Эти модификации повышают устойчивость олигонуклеотида к деградации нуклеазой и улучшают его аффинность связывания с целевыми последовательностями, что делает его полезным инструментом для исследований in vitro и in vivo.

Другим типом модификации является введение модифицированных нуклеотидов, таких как 2'-О-метил или 5-метилцитозин, в базовую структуру олигонуклеотида. Эти модификации могут повысить специфичность олигонуклеотида и снизить риск неспецифического связывания с нецелевыми последовательностями, что делает их полезными для таргетной терапии.

Кроме того, для отслеживания олигонуклеотида in vivo и мониторинга его активности можно использовать ковалентные модификации, такие как конъюгация с флуоресцентной или радиоактивной меткой. Эти модификации также позволяют разрабатывать средства визуализации и терапевтические средства для диагностики и лечения заболеваний.

Будущие применения синтеза олигонуклеотидов

Возможность синтезировать небольшие синтетические фрагменты ДНК с определенными последовательностями открыла новые возможности для изучения функции генов и создания новых терапевтических подходов. От персонализированной медицины и редактирования генов до регуляции генов — потенциал синтеза олигонуклеотидов будет продолжать расширяться, что приведет к появлению новых и полезных приложений.

Инновации и будущие применения олигонуклеотидов могут включать больший акцент на персонализированную медицину, если их объединить с CRISPR-Cas9 для внесения изменений в целевые специфические гены или транскрипты РНК, участвующие в различных болезненных процессах. Разработав олигонуклеотиды, способные воздействовать на определенные мутации или области генома, можно будет разработать методы лечения, адаптированные к индивидуальным потребностям каждого пациента.

ДНК-олигонуклеотиды также могут сыграть ключевую роль в продолжающейся разработке новых инструментов. Их и дальше будут использовать для исследования функций и регуляции генов. Синтезируя олигонуклеотиды, которые имитируют определенные регуляторные элементы, такие как области промотора или энхансера, исследователи могут получить более глубокое понимание того, как регулируются гены и как они способствуют развитию заболеваний.

Олигонуклеотидные синтезаторы BIORUS
 

Синтезатор олигонуклеотидов Oligo представляет собой компактную, гибкую, интуитивно понятную в работе автоматическую систему для быстрого синтеза олигонуклеотидов в объемах 1 мкмоль-12 ммоль. Он предназначен для сиетнеза последовательностей ДНК и РНК и  используется в лабораториях клинических исследований, фармацевтических разработок и синтеза молекулярно-диагностических зондов.

Синтезаторы Oligo представлены тремя моделями:

  • Oligo25, номинальный масштаб синтеза 1 мкмоль ~100 мкмоль;
  • Oligo100, номинальный масштаб синтеза 50 мкмоль ~ 9 ммоль;
  • Oligo150, номинальный масштаб синтеза 150 мкмоль ~ 12 ммоль;

В синтезаторах Oligo установлен высокоточный дозирующий насос, совместимый с реагентами, используемыми в процессе синтеза олигонуклеотидов. Принцип работы основан на проточном твердофазном синтезе, который позволяет значительно снизить расход реагентов и обеспечить точный контроль скорости реакции и времени контакта, высокую эффективность синтеза и удобен для линейного масштабирования.

Конструкция Oligo поддерживает до 14 входов для амидита и 1, 3 или 8 колонок для автоматического запуска процесса анализа.

Система спроектирована с оптимизированным каналом потока для уменьшения удерживаемого объема и небольшой занимаемой площади. Бутыли из амидита и другие бутылки с реагентами располагаются сбоку от системы. Клапаны, датчики и насосы расположены на открытой передней части, что обеспечивает легкий доступ. Рабочая станция системы Oligo обеспечивает эффективное управление данными, гибкое и простое создание методов, управление пользователями, контрольный журнал и анализ данных, предоставляя вам полную и надежную платформу для разработки методов.

Восстановить пароль