Роль факторов среды при культивировании клеток. Решения BIORUS для контроля и управления процессом культивирования

08.10.2023

Важнейшей задачей технолога при эксплуатации ферментеров на любом биотехнологическом производстве является обеспечение максимально благоприятных условий для роста культуры, увеличения выхода целевого продукта. Это касается как поддержания заданной температуры процесса, значения pH, так и состава питательной среды. Состав питательных сред должен в наибольшей мере соответствовать потребностям штамма-продуцента. В непрерывно действующих процессах культивирования задача технолога сводится к постоянному поддержанию необходимых концентраций питательных веществ (и кислорода) в ходе промышленной эксплуатации ферментера и дозированному введения кислоты/щелочи для pH-статирования. Более сложные проблемы возникают при производстве метаболитов, когда в ходе периодического процесса культивирования состав среды, окружающей клетки штамма-продуцента, должен изменяться в зависимости от фазы роста культуры, ее состояния и уровня активности. Именно это обстоятельство затрудняет перевод такого рода производств на непрерывный режим эксплуатации, да и при периодическом режиме требует от обслуживающего персонала постоянного контроля и управления процессом.

Для решения этих задач современный этап развития промышленной биотехнологии требует надежных экспресс-методов количественного изучения свойств живых клеток как продуцента целевого продукта, а также концентрации питательных веществ и метаболитов. В последние годы разрабатываются и внедряются новые аппаратурные решения для всестороннего экспресс-контроля культуры и питательной серды. Относительно новым классом подобных приборов являются биотехнологические анализаторы, с помощью которых можно получать данные о концентрации питательных веществ и метаболитов в культуральной среде в режиме онлайн. 

Обзор основных факторов культуральной среды 

В таблице ниже приведены факторы культуральной среды, которые определяют рост и биосинтетическую активность продуцентов. Рассмотрим данные факторы и методы управления ими более подробно.

Состав и концентрация питательных веществ определяют метаболизм клеток-продуцентов. В зависимости от типа процесса в качестве таких веществ могут выступать глюкоза, сахароза, лактоза, ксилоза, крахмал, целлюлоза, этанол и др. Состав питательных веществ определяется на этапе составления композиции питательной среды, а концентрация может поддерживаться или меняться в ходе ферментации в зависимости от способа.

При периодическом способе культивировании в ферментер загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание микроорганизмов проводят в оптимальных условиях в течение определенного времени, после чего процесс останавливают, сливают содержимое ферментера и выделяют целевой продукт. Этап роста культуры включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, фазу замедления роста, стационарную фазу, фазу отмирания.

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой. Существует также объемно-доливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентного объема среды (полунепрерывное культивирование).

При непрерывном способе питательная среда непрерывно подается в ферментер (биореактор), в котором создают оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментера (биореактора) также непрерывно вытекает культуральная жидкость вместе с микроорганизмами. В непрерывных процессах биообъект поддерживается в экспоненциальной фазе роста. При этом существует равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Продукты метаболизма (например, лактата или аммиака) и ингибиторы замедляют биохимические реакции, а следовательно, и в целом процесс ферментации. Такие вещества следует выводить из среды ферментации. Для этой цели в настоящий момент могут быть использованы ряд инструментальных решений, например, ротационный фильтр. (Роторный фильтр основан на технологии просеивания при вращении. Он может быть вставлен непосредственно в сосуд биореактора или использоваться как внешняя проточная система. В первом случае преимущество состоит в компактности системы.)

Значение pH и температуры регулируют скорость биохимических реакций. Кислотность питательной среды особое значение имеет для биохимических реакций, протекающих в клетках-продуцентах. Концентрация в растворе ионов водорода оказывает влияние на физико-химические свойства и биологическую активность белков и нуклеиновых кислот, поэтому для оптимального протекания культивирования поддержание кислотно-основного гомеостаза является задачей исключительной важности. В ферментере постоянное значение pH поддерживается путем дозирования щелочи/кислоты. В зависимости от природы продуцента оптимальный диапазон значения pH могут различаться. Например, при культивировании большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2—7,4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,5—9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2—6,8).

Задача термостатирования, то есть поддержания постоянной температуры процесса  в диапазоне 2-3 градусов, аппаратурно решается с помощью термостатирующих рубашек (водяных, воздушных  и др). Например, оптимальная температура культивирования клеток млекопитающих составляет составляет +36-37 градусов, насекомых +20-25 градусов.

Осмотическое давление является важнейшим физиологическим параметром, в ходе культивирования оно поддерживается с помощью разбавления или добавления новых порций среды. Величина осмотического давления питательных сред в основном зависит от концентрации NaCl, оптимальное значение при +38 градусов составляет 7,6 атм.

Технологическое оформление биотехнологических процессов в сильной степени определяется отношение микроорганизма – продуцента к кислороду. Культуры бывают как аэробные, так и анаэробные. В первом случае кислород обеспечивает метаболизм. Анаэробная ферментация может проводиться в условиях полной защиты  культуральной среды от кислорода (если микроорганизмы являются облигатными анаэробами) или просто без подачи дополнительной кислородной смеси.

Углекислый газ служит источником углерода для автотрофов. Некоторые гетеротрофные микроорганизмы нуждаются в нем, а некоторые наоборот замедляют метаболизм в присутствии СО2. Поэтому концентрация углекислого газа во многих случаях является важным параметром процесса ферментации.

Конструкция мешалки ферментера, а также скорость ее вращения регулирует процессы массопереноса, трансфера питательных веществ  к продуцентам и отвода метаболитов.
 

Фактор	Роль при культивировании	Методы управления фактором
Состав и концентрация питательных веществ	Обеспечивает метаболизм	Составление оптимальной композиции; подпитка во время ферментации; непрерывность процесса; многостадийность с учетом потребностей продуцента по фазам развития и др.
Концентрация продуктов и ингибиторов	Замедляет биохимические реакции	Осаждение продукта по мере накопления; ферментация с диализом; ферментация под разрежением с испарением летучего продукта и др.
рН	Оптимизирует скорости биохимических реакций	Регулирование путем добавления кислоты или щелочи
Температура	То же	Охлаждение или подогрев культуральной жидкости при помощи теплообменников или температуры подаваемых в биореактор субстратов
Осмотическое давление или активность воды	Определяет границы жизни (составляет 0,6-0,998)	Составление сред с оптимальной концентрацией питательных веществ или влажностью твердой среды; поддержание на постоянном уровне во время ферментации путем разбавления водой или добавлением отдельных компонентов
Содержание растворенного кислорода	Для аэробов обеспечивает аэробный метаболизм; является акцептором Н+; ингибирует развитие анаэробов	Для аэробных процессов регулируют интенсивностью аэрации или добавлением к газовой смеси кислорода. Анаэробные процессы реализуют в бескислородной среде
Содержание диоксида углерода	Источник углерода для автотрофов; некоторые гетеротрофы нуждаются, а некоторые замедляют метаболизм в присутствии СО2	Продувание в фотосинтезирующих процессах ферментации газовой средой, обогащенной СО2; выделению СО2 из жидкой фазы способствует перемешивание
Перемешивание среды	Равномерное распределение питательных веществ и биомассы по всему пространству среды	Организуют макро- и микроперемешивание при помощи механических мешалок, барботажных, циркуляционных и других систем
Вязкость среды	Определяет диффузию питательных веществ и перемешивание клеток продуцента	Регулирование компонентами питания, характером и концентрацией биомассы, наличием некоторых полимерных продуктов. Вязкость влияет на перемешивание и аэрацию; требуются специальные технические средства

 

Возможности ферментеров для контроля и управления факторами среды. Биотехнологические анализаторы

Ферментер (биореактор) занимает ключевое место в аппаратурном оформлении биотехнологического процесса. Он представляет собой аппарат для глубинного выращивания (культивирования) микроорганизмов (или культур клеток) в питательной среде в условиях стерильности, интенсивного перемешивания, непрерывного продувания стерильным воздухом и постоянной температуры.

Современные ферментационные аппараты позволяют контролировать и управлять процессом культивирования клеток и добиваться высоких результатов в получении целевого продукта. Однако даже самый современный ферментер не позволит технологу контролировать и управлять всеми факторами среды. Во многих случаях технолог или оператор ферментеров вынужден использовать рутинные методики для определения, например, концентрации метаболитов или питательных веществ. В качестве альтернативы рутинным методикам в последнее время широкое распространение получили биотехнологические анализаторы. Их работа основана на использовании биосенсоров, время выполнения анализа составляет 1-2 мин.

Данные о биотехнологическом процессе, полученные с помощью ферментера и биотехнологического анализатора, являются мощным инструментом для управления ферментацией в непрерывном и периодических режимах. Новый биотехнологический анализатор BIORUS (аналог всемирно известного анализатора BioProfile FLEX от компании NOVA Biomedical) способен заменить несколько отдельных приборов или рутинных методик.  Анализатор позволяет оператору в экспресс-режиме измерять концентрации питательных веществ, метаболитов, осмотическое давление, а также измерять физиологический статус продуцента. Кроме того анализатор может быть интегрирован в контроллер ферментера, а управление подпиткой автоматизировано.

Применение биотехнологического анализатора BIORUS

Онлайн детектирование концентрации растворенного кислорода, значения pH и концентрации глюкозы при культивировании Lactobacillus Plantarum
 

Онлайн детектирование концентрации растворенного кислорода, значения pH и концентрации глюкозы при культивировании Saccharomyces cerevisiae

Онлайн детектирование концентрации растворенного кислорода, и концентрации глюкозы и лактата при культивировании Saccharomyces cerevisiae

Онлайн детектирование параметров среды при получении лизина

 

Выводы

Современные ферментеры позволяют контролировать и управлять основными параметрами культуральной среды, но только с их применение невозможно решить задачу оперативного контроля концентрации питательных веществ и метаболитов, а также изучения физиологического статуса продуцента. Использование биотехнологических анализаторов (аналогов BioPofile FLEX от компании NOVA Biomedical) является эффективным и надежным экспресс-инструментом количественного изучения свойств продуцента, концентрации питательных веществ и метаболитов.