Процессы выделения и очистки целевого продукта (downstream) в биофармацевтическом производстве

04.17.2022

В биофармацевтическом производстве выделение целевого продукта является ключевым технологическим этапом и означает выделение и очистку лекарственного вещества, получаемого при культивировании клеток. Технологии выделения целевого продукта применяются для получения Mab (моноклональных антител), терапевтических белков, ферментов, вирусных вектороы, вакцин и тд.

Задача выделения целевого продукта — извлечение, очистка и концентрирование ранее синтезированной биомолекулы или другого продукта из сложной несущей матрицы. В ходе downstream процесса удаляются как технологические примеси, так родственные к целевой молекуле. К технологическим примесям можно отнести: производные культивирования (upstream процесса) (компоненты питательных сред и др.), производные культуры клеток (фрагменты клеточных стенок, нецелевые белки, молекулы ДНК и др.), производные downstream процесса (растворители, смытые фрагменты сорбентов и др.). К родственным примесям можно отнести: модифицированные формы целевого белка, агрегаты, фрагменты.

Типовые этапы процесса downstream

• Сбор и фильтрация
  Сбор материала — первый этап извлечения продукта из технологической среды, на котором необходимо обеспечить требуемый выход и качество продукта.
• Первичное улавливание (capture)
  Задача улавливания/ захвата состоит в полном выделении целевого продукта с минимальным захватом побочных и загрязняющих компонентов. Считается, что при улавливании, в отличие от этапа сбора материала, основная масса отходов уже удалена.
• Замена буфера и концентрирование
  Для концентрирования разбавленного продукта и разделения растворенных веществ применяется ультрафильтрация. Она осуществляется на основании размера пор мембраны или предельной молекулярной массы. Диафильтрация происходит путем перевода продукта в новый буферный раствор для продолжения или завершения формирования конечного состава. Ультрафильтрация и диафильтрация являются операциями замены буфера.
• Очистка (purification, polishing)
  В ходе очистки соответствующими методами последовательно удаляются остаточные примеси при минимальных потерях продукта. Очистка должна привести к достижению максимального выхода продукта заданной степени чистоты.
• Приготовление лекарственной формы
  В результате приготовления готовой лекарственной формы лекарственное вещество переходит в состав лекарственного препарата. При этом молекулы продукта переходят из окружающей среды, растворителя или другого физического состояния в форму, подходящую для клинического применения.

Сбор и фильтрация

• Глубинная фильтрация, разделение на полых волокнах. Для сбора материала в зависимости от свойств продукта могут применяться глубинная фильтрация или разделение на полых волокнах. При глубинной фильтрации смесь прокачивается через мембрану для отделения загрязнений от продукта в жидкой суспензии. Фильтры из полых волокон используются в непрерывных биотехнологических процессах для удаления целевой молекулы, когда часть биомассы временно захвачена фильтром из полых волокон.
• Центрифугирование. Один из наиболее распространенных методов разделения в биотехнологии, приводящий. Однако, недостатками этого метода являются риск разрушения клеток под действием центробежной силы, а также слишком густая биомасса на выходе. Центрифугирование часто является лимитирующей стадией и мало пригодно для организации непрерывных биотехнологических процессов.
• Кислотный лизис / лизис с помощью ПАВ, абсорбция органической фазой. Путем лизиса, как правило, достигается основная цель — эффективно разрушаются изолирующие структуры, содержащие лекарственное вещество или продукт, и создается физическая граница между любыми остатками или другими примесями и лекарственным веществом. Кислотный лизис или лизис с помощью ПАВ почти исключительно используется для экспрессии бактерий и, в отдельных случаях, дрожжей. Точно так же абсорбция и улавливание продукта органической фазой часто используются в бактериальных системах экспрессии и продуцирования, а также иногда в дрожжевых системах.
• Флокуляция и осаждение. Это методы активного воздействия на системы частиц с целью разделения. Флокуляция используется в основном для подготовки к фильтрации или центрифугированию. Применение флокуляции обеспечивает быстрое прохождение жидкости через фильтрационные установки. Кроме того, это эффективный и недорогой способ отделения клеточного материала от супернатанта. Могут потребоваться протоколы верификации и дополнительные операции для удаления флокулянта. Осаждение — это метод активного воздействия на частицы путем изменения свойств растворителя или ионной силы раствора для уменьшения растворимости.

Улавливание

Методы и стратегия улавливания могут незначительно меняться в зависимости от свойств целевого вещества. Антитела улавливаются в основном аффинными смолами, такими как белок A и белок G. Одна из главных особенностей очистки моноклональных антител по сравнению с другими белками – использование хроматографии с белком A. Это белок клеточной стенки золотистого стафилококка, который сильно и селективно связывается с антителами при нормальном pH и слабо – при пониженном. Благодаря высоким выходам и чистоте получающегося продукта это предпочтительный метод на первом этапе очистки антител.

Для улавливания белков, не являющихся антителами, и олигонуклеотидов чаще применяется ионообменная хроматография. Полисахариды и сложные гликаны часто улавливают с помощью гидрофобной хроматографии  или хроматографии с обращенными фазами.

• Аффинная хроматография (A/G-белки)  — это хроматографический процесс первого прохождения (белок A), в ходе которого целевой продукт (как правило Mab) отделяется от других растворимых компонентов и концентрируется за счет обратимого связывания или захвата целевого белка в колонке  по специфическому механизму взаимодействия, в то время как остальные компоненты свободно «вымываются» через колонку. Затем, после нескольких стадий промывки, целевые молекулы извлекаются селективным вымыванием.
• В процессе ионообменной хроматографии целевые продукты (белки, нуклеотиды и др.) отделяются от других растворимых компонентов за счет обратимого связывания или захвата целевой молекулы в колонке под действием силы электростатического взаимодействия с материалом твердой фазы, в то время как остальные компоненты свободно «вымываются» через колонку. Ионообменная хроматография регулярно используется в качестве дополнительного или альтернативного метода очистки, и ее применение не ограничивается только улавливанием.
• Другие виды хроматографии. Гель-хроматография (SEC или гельфильтрация) позволяет проводить разделение веществ с различным размером молекул. SEC можно использовать для очистки белков (фракционирование) или для группового разделения, при котором образцы подразделяются на две большие группы. Хроматография с гидрофобным взаимодействием разделяет белки с различными гидрофобными свойствами. Разделение основано на двустороннем взаимодействии между белком и гидрофобной поверхностью хроматографической матрицы. Мультимодальная хроматография осуществляется с помощью мультимодальных сорбентов, например, Capto Adhere и Capto MMC, которые специально разработаны для получения нестандартной селективности. Заряженный лиганды дополняются дополнительными функциональными группами, которые привносят дополнительное взаимодействие (комбинация водородного, гидрофобного и ванн-дер-ваальсова взаимодействия).

Замена буфера и концентрирование

Ультрафильтрация часто используется в процессах выделения целевого продукта для концентрирования разбавленных потоков. Метод ультрафильтрации предназначен для разделения находящихся в растворе молекул за счет размера пор мембраны или по предельной молекулярной массе. Метод диафильтрации наиболее часто используется для перевода продукта в требуемый буферный раствор (например, из элюирующего буфера в буфер конечного лекарственного состава).

При ультрафильтрации и диафильтрации (методы замены буфера) исходный поток обычно направлен параллельно, а не перпендикулярно поверхности мембраны. Такой метод называют тангенциальной фильтрацией. Степень концентрирования продукта контролируют обычно с помощью УФ-детектора.

Очистка

Для повышения чистоты лекарственного вещества в определенной последовательности используется несколько методов. Очистка начинается с предварительного осветления и экстракции, за которыми следует тот или иной метод улавливания и первая стадия выделения основного объема, затем выполняются промежуточные и заключительные этапы, последние из которых включают завершающую хроматографическую очистку, стерилизующую фильтрацию, кристаллизацию и удаление вирусов.

Приготовление лекарственной формы

Цель приготовления лекарственной формы — перенос молекул лекарственного препарата, находящихся в технологической среде, растворителе или другом физическом состоянии в состояние, подходящее для клинического применения у людей. Лекарственный препарат переводится в форму, соответствующую способу приема лекарства — ингаляции, инъекции или пероральному употреблению. Помимо стерильности, удаление примесей и эндотоксинов и предотвращение деградации белкового лекарственного препарата имеет важное значение для обеспечения безопасности и эффективности во время его производства и длительного хранения.

Лекарственные формы могут содержать белки (главным образом Mab), полисахариды, системы наночастиц, органические соединения, олигонуклеотиды и вакцины разных типов. Лекарственные формы некоторых вакцин содержат адъюванты, обычно в виде частиц на основе соединений алюминия или органических эмульсий.

Решения для процессов выделения и очистки (downstream) от компании BIORUS

Оборудование и расходные материалы для процессов downstream от компании BIORUS^® - идеальное решение для очистки целевого препарата в биотехнологическом производстве. Мы предлагаем качественные и доступные для российских заказчиков фильтрационные и системы для препаративной хроматографии белков, а также комплектующие и расходные материалы к ним:

• Системы тангенциальной и тупиковой фильтрации
• Капсульные, кассетные фильтры
• Фильтры на полых волокнах (hollow fiber)
• Пилотные и промышленный системы для препаративной хроматографии белков
• Сорбенты для хроматографии

Этапы подготовки коммерческого предложения на фильтрационную систему BIORUS

• Получение технического задания от заказчика на систему тангенциальной фильтрации (лабораторную, пилотную, промышленную) или коммерческого предложения на систему от известных производителей для подбора аналога
• Дополнительное согласование опций (датчиков pH, электропроводности и др.) и дополнительного оборудования (циркуляционный охладитель) в случае необходимости
• Подбор фильтрационных элементов/ фильтров, в том числе аналогов ведущих мировых производителей в случае необходимости
• Подготовка схемы, описания модулей фильтрационной системы (модуль фильтрации, рециркуляции и др.) с указанием материалов и производителей элементов
• Расчет окончательной стоимости утвержденной системы с учетом доставки, комплекта документации, пуско-наладочных и других необходимых работ
• Разработка и предоставление 3D-чертежа фильтрационной системы после размещения заказа

Хроматографические системы от компании BIORUS

• Стандартные модели хроматографических системы со скорость потока до 1200 л/ч
• Стандартные модели колонн диаметром до 1200 мм. Ручные (аналоги колонок BPG) и автоматические (аналоги AxiChrom и Chromaflow)
• Кастомизированные хроматографические системы и колонки увеличенной производительности и опциями (дополнительными датчиками воздуха, pH, электропроводности и др. )