Методы и стратегии оптимизации микробиологической ферментации

10.27.2024

Недавнее возрождение интереса промышленности к микробной ферментации для производства биопрепаратов можно объяснить несколькими факторами, включая достижения в области биохимии и растущее понимание того, когда гликозилирование нежелательно. Кроме того, появление новых форматов белков и каркасов, которые хорошо подходят для этой технологии производства, наряду с их применимостью для производства ДНК-плазмид, способствовало этой тенденции. Успешные усилия по оптимизации могут привести к масштабируемым процессам ферментации, которые не только достигают высоких титров и производительности, но также демонстрируют значительную устойчивость и надежность.

Экономическая эффективность микробной ферментации по сравнению с клеточной культурой делает ее весьма привлекательной при правильных обстоятельствах. Однако еще предстоит решить несколько проблем. Бактерии и дрожжи, как правило, не обладают клеточным аппаратом, необходимым для обработки сложных биологических структур, что делает критически важным определение наиболее подходящей системы производства для каждой целевой молекулы. Еще одной существенной проблемой является недостаточное понимание системы и процесса экспрессии, что усложняет производство соответствующего количества белка с желаемым качеством. К счастью, поскольку отрасль все чаще внедряет более чувствительные технологии, теперь можно получить более глубокое понимание качества продукта на более ранних стадиях разработки, чем когда-либо прежде. Это достижение требует большего количества итераций разработки, чтобы гарантировать, что качественные характеристики продукта достигаются на ранних стадиях процесса.

При масштабировании микробной ферментации контроль процесса может представлять трудности, особенно в отношении скорости переноса кислорода и управления теплом. Для быстрорастущих бактериальных культур важно обеспечить достаточный перенос кислорода по всей системе культивирования для максимального роста. Это, в свою очередь, требует адекватного перемешивания и скорости потока воздуха. Управление теплом имеет решающее значение, поскольку микробная ферментация обычно требует точного контроля температуры, обычно в пределах ±1 или 2 °C. Микробная ферментация генерирует больше тепла, чем клеточная культура, и все избыточное тепло должно рассеиваться оборудованием, чтобы предотвратить неконтролируемые скачки температуры. Это может стать серьезной проблемой при масштабировании для производства.

Использование антибиотиков для отбора бактерий, способных поддерживать высокие уровни экспрессии желаемого продукта, представляет собой уникальную проблему в бактериальной ферментации. Во время последующей обработки необходимо удалить антибиотики, и регулирующие органы ожидают, что производители продемонстрируют эффективное удаление. Эта цель обычно достигается путем использования очень низких начальных концентраций определенных антибиотиков и проверки их удаления с помощью целевых аналитических методов, а также с помощью эффектов разбавления, наблюдаемых на нескольких этапах очистки. Кроме того, разработка систем-хозяев, которым не требуются антибиотики, при этом обеспечивая стабильную экспрессию, стала важной целью в производстве рекомбинантных белков и плазмид. Увеличение производства плазмид представляет собой еще одну проблему; производство большего количества плазмид не так просто, как простое увеличение количества клеток. Сохранение плазмиды может повлиять на рост клеток, что требует баланса для оптимизации как выхода плазмид, так и скорости роста, чего может быть трудно достичь.

Другой характеристикой, которая влияет на пригодность микробной ферментации для биофармацевтического производства, является способность конкретного микроорганизма к гликозилированию. Escherichia coli (E. coli) может выполнять только ограниченное количество посттрансляционных модификаций, тогда как дрожжи могут гликозилировать белки, хотя и не так, как клетки млекопитающих. Тип посттрансляционных модификаций, необходимых для продукта, определит наиболее подходящий организм-хозяин. Хотя некоторые модификации могут быть выполнены in vitro, предпочтительным подходом является использование клеточного аппарата организма-хозяина. Хотя может быть возможным улучшение результатов за счет оптимизации параметров процесса, существующие пути не могут быть полностью заменены. По этим причинам E. coli и дрожжи служат эффективными и взаимодополняющими системами производства биомолекул, не требующими человеческого гликозилирования.

Для процесса ферментации мониторинг параметров производства в реальном времени для улучшения контроля процесса стал важнейшей задачей для биофармацевтической промышленности. Внедрение технологии анализа процессов (PAT) во время ферментации может выявить потенциально проблемные изменения и облегчить ручные или автоматизированные корректировки для возвращения процесса в центр проверенного рабочего диапазона. Используя PAT для обеспечения успеха и последовательности, можно сэкономить время и ресурсы, поддерживая при этом самые высокие стандарты качества.

Оптимизация процесса микробной ферментации для производства белка требует тщательного рассмотрения типа используемого организма. В некоторых конструкциях процесса организм-хозяин может эффективно секретировать белок в ферментационную среду, что позволяет относительно просто извлекать его с помощью методов тангенциальной фильтрации потока (TFF) на основе полых волокон. Напротив, в других процессах, например, с участием E. coli, белок вырабатывается в цитоплазме либо в виде растворимого белка, либо в виде нерастворимых включений. Эти различные методы производства требуют индивидуальных стратегий сбора в зависимости от конкретного получаемого продукта. Белки, удерживаемые в цитоплазме, требуют полного лизиса клеток, который может быть достигнут с помощью механических методов, таких как гомогенизация под высоким давлением. Напротив, белки, полученные в виде нерастворимых включений, требуют процедур разворачивания и повторного сворачивания для получения растворимых, правильно сложенных продуктов. Эти дополнительные шаги увеличивают сложность процесса и могут внести больше примесей или потенциально повредить конечный продукт.

Инженерия клеточной линии является многообещающей стратегией для решения этой проблемы, фокусируясь на содействии образованию правильно сложенных молекул внутри клеток. Однако это требует особого подхода и индивидуального процесса для каждого продукта, что требует значительного времени и усилий при выборе хозяина и ранней разработке процесса. Для достижения максимально возможного титра и выхода важно выбрать наиболее подходящий организм, систему экспрессии, последовательность операций блока и условия эксплуатации с самого начала проекта.

Разнообразие процессов ферментации и молекул, которые они производят, затрудняет создание универсальных процессов микробной платформы ферментации. Разработка универсальной линии клеток и плазмидной платформы, которые можно эффективно использовать на основе конкретного типа белка или продукта, была бы многообещающим решением для решения существенных проблем в ферментации. Кроме того, принятие платформенного подхода для последующих этапов обработки может помочь стандартизировать некоторые аспекты этих производственных процессов. Хотя платформенные решения для производства плазмидной ДНК становятся все более распространенными, эти подходы по-прежнему требуют гибкости для размещения различных плазмид и форматов.

Еще одной важной областью внимания является согласованность между партиями. Регулирующие органы установили четкие руководящие принципы для разработки процессов ферментации, которые соответствуют требованиям качества. Это включает в себя понимание системы и ее функциональности, а также определение проектного пространства, в котором может происходить ферментация. Системный подход имеет важное значение при разработке и оптимизации процесса, включая экспериментальное исследование дизайна для понимания взаимодействия линий клеток и условий культивирования, а также влияние на рост и выход продукта. Большинство работ по разработке и характеристике процесса можно смоделировать с использованием небольших ферментеров в лабораторных условиях. Согласование между лабораторными и заводскими моделями имеет важное значение для тонкой настройки процессов и гарантии надежной производительности. Однако поддержание согласованности по различным параметрам может быть сложной задачей, особенно для критических факторов, как концентрация растворенного кислорода. Тщательное рассмотрение типа используемого резервуара является жизненно важным для оптимизации согласованности между моделями. Согласование малых и крупных моделей позволяет исследовать отклонения от нормальных условий и ускоряет анализ согласованности и отклонений процесса, а также снижает затраты. Лабораторные модели могут быть использованы для идентификации сырья и оценки риска изменчивости в производственных циклах. Оптимизация реакций ферментации не должна фокусироваться только на выходе; также важны надежность процесса, последовательность и другие критические атрибуты, включая кислород и его перенос. Разработка процесса должна учитывать ожидаемые целевые выходы и конечную цель ферментации, чтобы избежать проблем с масштабируемостью.