Изучение разрушения клеток E.Coli с помощью гомогенизатора высокого давления

01.10.2024

Разрушение клеточной стенки часто является основным этапом выделения продукта, особенно когда используются продукты, как Escherichia coli, которые обычно не выделяют продукт. Из доступных методов гомогенизация под высоким давлением преобладает при умеренных или больших объемах процесса.

Гомогенизатор высокого давления  по существу представляет собой насос объемного действия, который пропускает клеточную суспензию через клапан, прежде чем поток на высокой скорости ударяет по ударному кольцу. Рабочее давление достигает 1500 бар. Вязкость продукта существенно варьируется в зависимости от процентного содержания упакованных клеток (PCV) Escherichia coli. Вязкость клеточного распада после одного прохода через ПВД очень высока, но быстро снижается при последующих проходах. Разрушение клеток с помощью гомогенизаторов высокого давления дает дезинтеграцию с вязкостью, которая становится низкой уже после одного прохода и которая еще больше снижается после последующих проходов.

Оценка эффективности гомогенизатора высокого давления для разрушения клеток и очистки фермента из обработанной Escherichia coli. Наиболее эффективные рабочие условия для уничтожения Escherichia coli были разработаны и представлены в этом отчете об исследовании. Это исследование было проведено на гомогенизаторе высокого давления BIORUS Nano для оценки эффективности разрушения клеток и очистки термочувствительного фермента SMTL из Escherichia coli . В ходе исследования было показано, что 92 % желаемого разрушения клеток наблюдается при давлении 1200 бар при двух пропусках 10 % PCV суспензии E. coli через гомогенизатор высокого давления.

Цель

Целью исследования является оценка гомогенизатора высокого давления  для разрушения клеток и очистки термочувствительного фермента SMTL из Escherichia coli.

Критерий успеха:

• Оценить гомогенизатор высокого давления на эффективность разрушения клеток E.Coli при 10% PCV.
• Очистка термочувствительного фермента во время гомогенизации.

План эксперимента

• Вязкость продукта значительно варьируется в зависимости от процентного содержания упакованных клеток (PCV) Escherichia coli.
• Для оценки эффективности разрушения клеток для исследования рассматривали 10% объема упакованных клеток Escherichia coli.
• Для исследования использовался гомогенизатор высокого давления BIORUS Nano.
• Подробная информация о гомогенизаторе высокого давления BIORUS Nano:

Модель	BIORUS Nano
Производительность	6-10 л/ч
Рабочее давление	1500 Бар

• Подробная информация об исходной суспензии

Название продукта	Фермент SMTL
Клетки-продуцент	E.Coli
PCV %	10%

• Подробности испытаний

Модель гомогенизатора	BIORUS Nano
Объем образца	1000 мл
Цель эксперимента	Оценка эффективности разрушения клеток методом гомогенизации под давлением

Описание методики испытания

• Вход и выход охлажденной воды подключены к выходному охлаждающему змеевику гомогенизатора, поддерживается температура 10°C в циркуляционном охладителе и поддерживается рециркуляция.
• Очистили узел головки насоса гомогенизатора выского давления очищенной водой, а затеми пролил буфером для лизиса при частоте насоса 40 Гц.
• После очистки узла головки насоса один конец силиконовой трубки подсоединяется к выпускному отверстию гомогенизатора, а другой конец вставляется в бутыль емкостью 1 л для сбора лизата. Бутылка объемом 1 л покрыта льдом для поддержания температуры.
• Подключил воронку с сеткой к подающему фланцу. Подающая воронка заполняется продуктом, отфильтрованным с размером ячеек 60-100 мкм.
• Насос запускается с частотой 40 Гц, и ручка давления медленно и равномерно поворачивается по часовой стрелке, чтобы увеличить давление до 1000 бар в пропорции 100 бар/10 секунд.
• Образцы отбирали в начале и в конце гомогенизации, чтобы проверить эффективность разрушения клеток.
• Эффективность разрушения клеток оценивали при двух разных давлениях (1000 бар и 1200 бар) в одинаковых условиях: частота насоса 40 Гц и 10% объем упакованных клеток (PCV).
• В ходе работы все параметры процесса контролировались и записывались.
• В этом исследовании был выделен чувствительный к температуре фермент SMTL и его активность исследована стандартными методами. Чтобы проверить эффективность разрушения клеток, образцы тестировали на поглощение при длине волны 600 нм стандартным спектрофотометрическим методом.
• Суспензию E. Coli охлаждали до 4-6°C перед обработкой через гомогенизатор высокого давления и на выходе (гомогенизированный раствор) также поддерживали те же условия рядом в тех же условиях.
• После завершения работ систему очистили 0,1 М раствором NaOH.

Подаваемая суспензия (10% PCV E.Coli)
Процесс гомогенизации
Лизат (гомогенизированный продукт)

 

Результаты и их обсуждение 

• Для оценки эффективности разрушения клеток для исследования рассматривают 10% объема упакованных клеток Escherichia coli.
• Рабочими параметрами, которые влияют на эффективность гомогенизатора высокого давления, являются давление, температура, количество проходов гомогенизации и скорость потока.
• Эффективность разрушения клеток оценивалась при двух разных давлениях (1000 бар и 1200 бар) при постоянной частоте насоса 40 Гц и 10% объеме упакованных клеток (PCV).
• Количество проходов гомогенизации было ограничено двумя проходами и максимальным давлением 1200 бар, поскольку фермент чувствителен к температуре, и сохранение удельной активности фермента является важным фактором для оптимизации.
• При давлении 1000 бар результат показал 3,3-кратное снижение начальной мутности после 1 прохода и 8-кратное снижение мутности (OD600) после двух проходов.
• При давлении 1200 бар результат показал 4,3-кратное снижение начальной мутности после 1 прохода и 12-кратное снижение мутности (OD600) после двух проходов.
• Эффективность разрушения клеток увеличивается с каждым проходом через гомогенизатор высокого давления, как показано на графике ниже.
• • Эффективность разрушения клеток (%) при давлении 1000 бар: после 1-го прохождения по технологии HPH разрушение достигалось 70% с частичной экстракцией фермента из клетки-хозяина E.Coli, а после 2-го прохождения по технологии гомогенизации под давлением достигалось разрушение 88%. Результаты показали, что после двух проходов через гомогенизатор при давлении 1000 бар достигается разрушение на 88%.
• • Эффективность разрушения клеток (%) при давлении 1200 бар: после 1-го прохождения через гомогенизатор разрушение достигалось 77% с частичной экстракцией фермента из клетки-хозяина E.Coli, а после 2-го прохождения через гомогенизатор достигалось разрушение 92%. Результаты показали, что после двух проходов через гомогенизаторы высокого давления достигается 92% разрушения клеток, что является почти желаемым разрушением клеток.
• • Как показано на рисунке 2, 92 % желаемого разрушения клеток наблюдается при давлении 1200 бар при двух пропусках 10 % PCV суспензии E.Coli через гомогенизатор выского давления.

Заключение
• Сводка результатов испытаний:
 

Модель гомогенизатора	BIORUS Nano
Давление	1000 бар	1200 бар
Количество прогонов	2	2
PCV, %	10%	10%
% разрушенных клеток	87.5	92%

 

• Результаты исследования показали, что 92 % желаемого разрушения клеток наблюдается при давлении 1200 бар при двух пропусках 10 % PCV суспензии E. coli через гомогенизатор высокого давления.
• Скорость разрушения клеток пропорциональна примерно третьей степени турбулентной скорости потока продукта через канал гомогенизатора, которая, в свою очередь, прямо пропорциональна приложенному давлению. Таким образом, чем выше давление, тем выше эффективность разрушения за проход через гомогенизатор.
• Количество прогонов гомогенизации было ограничено двумя проходами и максимальным давлением 1200 бар, поскольку фермент чувствителен к температуре, и сохранение удельной активности фермента является важным фактором для оптимизации.

 

Гомогенизаторы высокого давления BIORUS

КУПИТЬ
ПРОВЕСТИ ИСПЫТАНИЯ