Биореакторы для культур клеток

01.12.2015

Биореакторы для культур клеток

Клетки животных во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов, в особенности системы перемешивания и аэрации, которые при работе не должны создавать стрессовых условий для культуры.

Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При этом необходимо учитывать чувствительность клеток к ранению. Обычно перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при низких скоростях. Пневматическое (воздушное) перемешивание в эрлифтных реакторах или гидравлическое перемешивание с помощью внешних насосов в реакторах с взвешенной твердой фазой ( fluidized bed reactors) также решает проблемы, связанные с культивированием.

Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками воздуха можно уменьшить объем подаваемой газовой смеси, использовать поверхностную продувку или безпузырьковую аэрацию через мембраны. При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом, азотом, воздухом и углекислым газом создается с помощью систем перемешивания газов.

Выращивание животных клеток можно осуществлять в стационарной ( batch), стационарной с подпиткой ( fed- batch) или непрерывной ( continuous) культуре с задержанием биомассы или без. При стационарном культивировании клетки растут без добавления субстрата после посева культуры. Однако, недостаток субстрата или образование токсичных продуктов метаболизма может снизить продуктивность. Чтобы избежать этих проблем применяют стационарное культивирование с подпиткой, при котором субстрат или другие необходимые вещества добавляют порциями или непрерывно. При непрерывном культивировании продукты метаболизма, ингибирующие рост - лактат, аммоний, удаляют, добавляя компенсирующий объем свежей среды, чтобы избежать недостатка субстрата для роста. Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с задержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что увеличивает продуктивность. Для задержания биомассы и предотвращения ее выноса с удаляемыми объемами культуральной жидкости используют различные системы фильтрации, например, роторные или вращающиеся фильтры.

Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к поверхности. Такие опорнозависимые клетки иммобилизуют на микроносителях, таких как стекло, целлюлоза, коллаген, желатин или пластик. Если носитель пористый, клетки могут расти внутри него, при этом они защищены от раневого стресса, что позволяет использовать более высокие скорости перемешивания и продувки в процессе культивирования.

Компания Bioengineering предлагает большой ассортимент реакторов для обеспечения наилучших условий культивирования различных типов клеток.

Клеточный ферментер - биореактор 

Клеточный ферментер (биореактор) представляет собой резервуар с мешалкой, сконструированный для культивирования клеток животных. Он доступен в пилотном и производственном масштабе (общим объемом до 2000 л). Для минимизации стресса при ранении перемешивание осуществляется лопастной мешалкой морского типа.

Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой, а также непрерывным благодаря наличию тензодатчиков. Реактор используется для культивирования взвеси клеток или клеток, иммобилизованных на микроносителях. Для задержания биомассы при непрерывном культивировании можно использовать роторные или спиральные фильтры (см. ниже).

Встроенное устройство пробоотбора обеспечивает стерильный отбор контагиозных клеток (например, для производства вирусов).

 

Для того, чтобы не травмировать клетки в процессе продувки можно установить различные системы аэрации, например, пульверизаторы (барбатеры), систему поверхностной аэрации или использовать безпузырьковую продувку через силиконовые трубочки.

Эрлифтный ферментер

В этих ферментерах перемешивание осуществляется потоком воздуха, а не лопастью мешалки, обеспечивая эффективный массоперенос и низкие силы рассечения. Для контроля за циркуляцией жидкости можно установить вытяжную трубу, направляющую поток пузырьков по центру. Распределение газа может осуществляться с помощью перфорированных, пористых или гидрофобных трубок. Если клетки могут повредиться пузырьками газа, можно установить систему безпузырьковой аэрации через силиконовые трубочки.

Биореакторы доступны как лабораторные, так и промышленные. Последние имеют широкую верхнюю часть, действующую как сепаратор газов.

Компания Bioengineering предлагает также visual safety airlift fermenter с рабочим объемом в 20 л, с легко снимаемой стерилизуемой фольгой вместо стеклянной или стальной оболочки. Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой или непрерывным. Эрлифтные ферментеры подходят для культивирования суспензий клеток, включая клетки насекомых.

 

 

Биореактор с взвешенной твердой фазой ( Fluidized bed reactor )

Биореакторы, которые поддерживают носители с иммобилизованными клетками в состоянии суспензии, называются реакторами с взвешенной твердой фазой ( fluidized bed reators).

Обычно в этих реакторах присутствует три фазы – твердая, жидкая и газообразная. Для непрерывного культивирования с задержанием биомассы используется специально разработанная система сепарации. Она состоит из различных камер и обеспечивает полное задержание частиц при перфузионных процессах.

Перемешивание достигается с помощью продувки. Это обеспечивает низкий раневой стресс и равномерный массоперенос. Для чувствительных клеток имеется система безпузырьковой аэрации через силиконовые мембраны (Forschungszentrum J?lich (a), Informationsblatt).

Общий объем реактора составляет 7 л, он поставляется как со стеклянным, так и со стальным цилиндром. В этих реакторах была достигнута высокая плотность клеток CHO, BHK и гибридомы (Forschungszentrum J?lich (b), Informationsblatt).

Биореакторы с взвешенной твердой фазой рекомендуются для клеток на микроносителях (т.е. нуждающихся в опорной поверхности), для клеток, чувствительных к раневому стрессу, для заключенных в капсулу клеток и для продуцирования продуктов секреции в долговременной культуре клеток.

Для защиты чувствительных клеток в ферментерах с взвешенной твердой фазой можно использовать систему безпузырьковой продувки через силиконовые трубочки (со стенками, армированными стекловолокном), которая предотвращает возникновение градиента кислорода в потоке.

Автоклавируемый ферментер с взвешенной твердой фазой (Autoclavable fluidized bed reactor)

Для лабораторных целей удобен автоклавируемый ферментер с взвешенной твердой фазой ( AWS). Он оборудован магнитным циркуляционным насосом непрерывного действия. Температура контролируется посредством циркуляционного термостата. Ферментер AWS закреплен на раме и может автоклавироваться со всеми аксессуарами.

 

Биореактор с фиксированной твердой фазой (Fixed bed reactor)

Как альтернативу для культивирования клеток, нуждающихся в фиксации для роста, можно использовать биореактор с фиксированной твердой фазой, в котором клетки и их носители захватываются в закрепленную подложку. Эта система не нуждается в сепарационных приемах для удаления жидкой фазы. Раневой стресс и повреждение клеток пузырьками газа минимальны.

В процессе культивирования через фиксированную подложку циркулирует насыщенная кислородом среда. Поэтому при аксиальном потоке длина подложки является критическим параметром, поскольку обеспечение культуры кислородом и питательными веществами может быть недостаточным. В больших реакторах эту проблему можно решить с помощью радиально распространяющегося потока. Среда, обогащенная продуктами метаболизма, удаляется непрерывно или периодически.

Компания Bioengineering предлагает вставные корзины с подложками для маленьких лабораторных ферментеров ( KLF) и лабораторных ферментеров ( NLF, 19 л). Среда через подложки распространяется радиально. Возможно увеличение объема подложки до 40-75 л (500-1000 л реакторы). В таких реакторах выращивают нуждающиеся в имобилизации и чувствительные к ранению клетки. Система подходит и для долговременного выращивания культур клеток с продуктами метаболизма.

Мембранный ферментер

 Мембранный ферментер состоит из внутренней и внешней камер, которые разделены диализной мембраной. Мембрана обеспечивает безпузырьковую продувку и задержание биомассы при непрерывном культивировании. С помощью мембранной технологии токсические (низкомолекулярные) метаболиты удаляются, а (высокомолекулярные) соединения удерживаются во внутренней камере (P?rtner et al. 1992). Перемешивание в каждой из камер осуществляется мешалкой. Среда и воздух поставляются во внешнюю камеру. Внешняя камера имеет общий объем 7.1 л, а внутренняя – 2.4 л. Биореактор был сконструирован для непрерывного культивирования, но может быть также использован в стационарных и стационарных с подпиткой процессах. Взвешенные клетки, а также клетки, нуждающиеся в закреплении на микроносителях, также могут выращиваться в этом биореакторе (Bohmann et al., 1992; Bohmann et al., 1993).

 

Системы фильтрации

Системы фильтрации используются при непрерывном культивировании клеток животных с задержанием биомассы. Компания Bioengineering предлагает два различных типа фильтров.

Роторный фильтр

 Роторный фильтр основан на технологии просеивания при вращении. Он может быть вставлен непосредственно в сосуд биореактора или использоваться как внешняя проточная система. В первом случае преимущество состоит в компактности системы. Второй вариант более гибкий, поскольку в процессе культивирования фильтр может быть демонтирован, промыт, простерилизован и подключен заново. Превосходное задержание биомассы (80% и более) без ее повреждения достигается даже при крупномасштабном культивировании, которое характеризуется долговременностью и высокими скоростями потока (S?meghy).

 

Спиральный фильтр

 

Спиральный фильтр основан на принципе мембранной фильтрации. Он был специально разработан для больших объемов прокачиваемой среды при минимальной затрате энергии (Winzeler 1990).Спиральный фильтр соединяется с биореактором с помощью проточной системы и может стерилизоваться как на месте, так и в автоклаве. Он особенно удобен для задержания клеток, а также для свободного от клеток пробоотбора, поскольку силы травмирования очень малы.

Список литературы

A. Bohmann, R. P?rtner, H. M?rkl
The membrane dialysis bioreactor – a reactor concept for continuous cultivation of animal cells. In: DECHEMA Biotechnology and Bioengineering, Vol, 41, 1993, 
1092-272

A. Bohmann, R. P?rtner, J. Schmiedling, V. Kasche, H. M?rkl 
The membrane dialysis bioreactor with integrated radial-flow fixed bed-a new approach for continuous cultivation of animal cells. In: Cytotechnology, 9, 1992, 51-57

Forschungszentrum J?lich GmbH (ed.) a 
Reaktorintegrierte blasenfreie Begasung von Wirbelschichtreaktoren. 
Informationsblatt des Forschungszentrums J?lich GmbH, J?lich o.J.

Forschungszentrum J?lich GmbH (ed.) b 
Integrated bioprocess engineering for antibody production. Informationsblatt des 
Forschungszentrums J?lich GmbH, J?lich o. J.

R. P?rtner, A. Bohmann, J. Schmiedling, V. Kasche, H. M?rkl 
Metabolic parameters and stability of suspended and immobilized hybridoma cells. 
In: DECHEMA Biotechnology conferences 5, Frankfurt a. M., 1992, 309-312

Z. S?meghy 
Improved cell retention system based on the rotating sieve technique. (A copy of the manuscript is available at Bioengineering AG)

H. B. Winzeler 
Spiral stack membrane module. High performance low energy input membrane separation unit. In: Chimia 44, 1990, 288-291